专题 7　生物技术实践

【核心概念】

• 基因工程：按照人们意愿，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。原理：基因重组；优点：定向改造生物性状、打破生殖隔离。

【关键内容 1：三种工具】

• 限制酶（分子手术刀）：识别特定核苷酸序列并在特定位点切割，产生黏性末端或平末端；作用于磷酸二酯键。
• DNA 连接酶（分子缝合针）：连接磷酸二酯键（连接的是骨架，不是氢键）。
• 载体（分子运输车，常用质粒）：需具备条件——①能自我复制 ②有一个至多个限制酶切割位点 ③有标记基因（如抗生素抗性基因，便于筛选）④对受体细胞无害。

【关键内容 2：四步流程（必背）】

• ① 目的基因的获取：从基因文库获取、PCR 扩增、人工合成；
• ② 基因表达载体的构建（核心步骤）：组成 = 目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（启动子≠起始密码子！启动子在 DNA 上驱动转录，起始密码子在 mRNA 上）；
• ③ 导入受体细胞：植物——农杆菌转化法（最常用）、花粉管通道法；动物——显微注射法（受精卵）；微生物——Ca²⁺ 处理法（感受态细胞）；
• ④ 检测与鉴定（四层次，高频排序题）：DNA 水平（PCR 检测是否插入目的基因）→ mRNA 水平（检测是否转录）→ 蛋白质水平（抗原—抗体杂交，检测是否翻译）→ 个体水平（抗虫/抗病接种实验）。

【关键内容 3：PCR 技术】

• 原理：DNA 半保留复制；条件：模板、引物（两种，分别与两条链 3' 端互补）、4 种脱氧核苷酸、Taq 酶（耐高温 DNA 聚合酶）。
• 三步骤循环：变性（90–95℃，氢键断裂）→ 复性/退火（50–60℃，引物结合）→ 延伸（72℃，Taq 酶合成新链）；n 次循环后目的片段约 2ⁿ 个。

【易错陷阱】

【核心概念】

• 培养基成分：碳源、氮源、水、无机盐（还需满足 pH、特殊营养物质）；类型：选择培养基（允许特定微生物生长、抑制其他，如以尿素为唯一氮源筛选分解尿素的细菌）与鉴别培养基（加指示剂，如伊红美蓝鉴别大肠杆菌——深紫色带金属光泽）。

【关键内容】

• 消毒 vs 灭菌：消毒——较温和，杀死部分微生物（煮沸、巴氏、酒精擦拭）；灭菌——杀死所有微生物包括芽孢和孢子（高压蒸汽灭菌：培养基；干热灭菌：玻璃器皿；灼烧灭菌：接种环）。
• 接种方法：平板划线法（逐步稀释分散得单菌落，不能用于计数）与稀释涂布平板法（可用于活菌计数，结果往往比实际值偏小——两个细胞连在一起只长一个菌落）。
• 计数对比：显微镜直接计数（偏大，含死菌）vs 稀释涂布平板法（偏小）。
• 传统发酵（菌种+条件，必背表）：

  产品	菌种	代谢类型	温度	条件要点
  果酒	酵母菌（真核）	兼性厌氧	18–30℃（教材作18–25℃）	先通气后密封；酸性重铬酸钾检验酒精（灰绿色）
  果醋	醋酸菌（原核）	好氧	30–35℃	全程通气；氧气糖源不足时酒精→醋酸
  腐乳	毛霉为主	好氧	15–18℃	毛霉蛋白酶/脂肪酶分解蛋白质和脂肪；加盐抑制杂菌
  泡菜	乳酸菌	厌氧	室温	无氧；亚硝酸盐含量先升后降（比色法测定）

【易错陷阱】

• 植物组织培养：理论基础——细胞全能性；过程：离体组织/细胞 →脱分化→ 愈伤组织 →再分化→ 胚状体/丛芽 → 完整植株；应用：快速繁殖、作物脱毒（用分生区如茎尖）、人工种子。
• 植物体细胞杂交：用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 → 原生质体融合（物理：电融合；化学：PEG）→ 再生细胞壁（融合成功标志）→ 组织培养成杂种植株；意义：打破生殖隔离、实现远缘杂交。
• 动物细胞培养：用胰蛋白酶/胶原蛋白酶分散组织细胞；贴壁生长、接触抑制；条件：无菌无毒、营养、适宜温度 pH、气体环境（95% 空气＋5% CO₂，CO₂ 维持 pH）。
• 单克隆抗体（流程最高频！）：
  • 流程：抗原注射小鼠 → 取 B 淋巴细胞 ＋ 骨髓瘤细胞 → 融合（PEG/灭活病毒）→ 第一次筛选：选择培养基（HAT）筛出杂交瘤细胞 → 第二次筛选：克隆化培养＋抗体检测，筛出能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 → 体内（腹水）/体外培养 → 单克隆抗体。
  • 优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备；应用：诊断试剂、治疗疾病、"生物导弹"（抗体+药物）。
• 核移植（克隆动物）：体细胞核＋去核卵母细胞（MⅡ期）→ 重构胚 → 代孕；克隆动物性状主要随供核个体（细胞质基因随卵母细胞）。

• 受精：获能精子＋MⅡ期卵母细胞；防止多精入卵：透明带反应（第一道）、卵细胞膜反应。
• 早期胚胎发育：受精卵→卵裂期（细胞增多、总体积不增加）→桑葚胚→囊胚（内细胞团＋滋养层）→原肠胚。
• 胚胎移植：意义——充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力；生理学基础：供受体同期发情处理（同情发情）、受体对移入胚胎基本不发生免疫排斥。
• 胚胎分割：选桑葚胚或囊胚，注意将内细胞团均等分割（否则影响分割后胚胎恢复和发育）；属于无性繁殖/克隆。

• 转基因生物安全性：食物安全/生物安全/环境安全三个争论层面；我国禁止生殖性克隆人、支持治疗性克隆。
• DNA 的粗提取与鉴定：DNA 不溶于酒精、与二苯胺沸水浴呈蓝色。
• 生态工程已在专题5展开，此处不重复。

• → 专题6 变异育种：基因工程育种的工具与流程细节；单倍体育种的花药离体培养=植物组织培养应用。
• → 专题4 实验探究：无菌技术、选择培养基设计同样遵循单一变量与对照原则。
• → 专题1 遗传：电泳条带分析与 PCR 结合考查基因型判断（新课标卷热点）。
• → 专题3 稳态与调节：单克隆抗体诊断/治疗与免疫知识结合。